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基于SSR分子標記‘云茄3號’的種子純度鑒定

蔚亞楠 龔亞菊 汪騫 黎志彬 鮑銳 李石開 吳麗艷

引用本文:
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基于SSR分子標記‘云茄3號’的種子純度鑒定

    作者簡介: 蔚亞楠(1997?),女,山東人,主要從事分子標記研究;
    通訊作者: 吳麗艷, wuliyan_123@sohu.com

Seed purity identification of eggplant cultivar ‘Yunqie No.3’ based on SSR molecular marker

    Corresponding author: WU Li-yan, wuliyan_123@sohu.com
  • 摘要: 為給云南省自育茄子品種‘云茄3號’的制種和大面積推廣應用提供技術支持,研究利用SSR分子標記技術對‘云茄3號’的親本(母本E26×父本E268)進行特異引物篩選,并將篩選出的呈共顯性的多態性引物在市場常見茄子品種中進行復篩,應用最終篩選出的標記引物對‘云茄3號’單株進行純度鑒定,對比田間植株純度檢測結果,驗證SSR分子標記種子純度鑒定的有效性. 研究結果表明,從66對已報道的備篩SSR引物中,篩選出2對引物(SM17和SM29)在親本中呈互補帶型的多態性引物,2對引物均能清晰地將‘云茄3號’與其它6個茄子雜交品種區分開來. 純度鑒定結果顯示,SSR分子標記檢測與田間植株純度鑒定結果一致,均達到了99%. 以上結果表明,在檢測種子純度方面,SSR分子標記與傳統的田間種植觀察相比有著簡單、高效的特點,可作為分子標記輔助手段,加快茄子優良品種的選育和推廣.
  • 圖 1  茄子基因組DNA條帶

    Figure 1.  DNA bands of eggplant genome

    圖 2  ‘云茄3號’及其親本SSR譜帶類型比較

    Figure 2.  Comparison on SSR band types between ‘Yunqie No.3’ and its parents

    圖 3  引物SM17和SM29在7個紫長茄雜交品種中的擴增表現

    Figure 3.  The SSR amplification results of primer SM17 and primer SM29 in 7 eggplant cultivars

    圖 4  引物SM17對茄子雜交種‘云茄3號’群體純度鑒定的SSR部分擴增結果

    Figure 4.  The partial SSR amplification results of primer SM17 for purity identification in ‘Yunqie No.3’ hybrid population

    圖 5  引物SM29對茄子雜交種‘云茄3號’群體純度鑒定的SSR部分擴增結果

    Figure 5.  The partial SSR amplification results of primer SM29 for purity identification in ‘Yunqie No.3’ hybrid population

    圖 6  茄子雜交種‘云茄3號’田間調查結果

    Figure 6.  Field properties investigation for ‘Yunqie No.3’ hybrid

    表 1  SSR多態性引物序列

    Table 1.  The primer sequences of polymorphic SSR

    引物名稱正向引物序列(5′-3′)反向引物序列(5′-3′)
    SM17ATCAATGACACCCAAAACCCATTTGTTTGAAAACCCAATACAAATCCGA
    SM29ATTGTGTCGATGAGATTTTGGTCAGTTTAGCTACGTTGGTTTGGTGCTGAA
    SSR174ATTGGTGAACGATGATCCTGAATGGTTTAGAGAATGGGATGAGATTGCTTCG
    SSR199ATCAAATGGGAGAAAATACTGCATCGTTTGGCTTAAACACACAACGTATATGGAC
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出版歷程
  • 收稿日期:  2020-01-13
  • 錄用日期:  2020-05-11
  • 網絡出版日期:  2020-06-22
  • 刊出日期:  2020-07-01

基于SSR分子標記‘云茄3號’的種子純度鑒定

    作者簡介:蔚亞楠(1997?),女,山東人,主要從事分子標記研究
    通訊作者: 吳麗艷, wuliyan_123@sohu.com
  • 1. 云南省農業科學院 園藝作物研究所,云南 昆明 650205
  • 2. 云南農業大學 農學與生物技術學院,云南 昆明 650201
  • 3. 云南省蔬菜種質創新與配套產業技術工程研究中心,云南 昆明 650205

摘要: 為給云南省自育茄子品種‘云茄3號’的制種和大面積推廣應用提供技術支持,研究利用SSR分子標記技術對‘云茄3號’的親本(母本E26×父本E268)進行特異引物篩選,并將篩選出的呈共顯性的多態性引物在市場常見茄子品種中進行復篩,應用最終篩選出的標記引物對‘云茄3號’單株進行純度鑒定,對比田間植株純度檢測結果,驗證SSR分子標記種子純度鑒定的有效性. 研究結果表明,從66對已報道的備篩SSR引物中,篩選出2對引物(SM17和SM29)在親本中呈互補帶型的多態性引物,2對引物均能清晰地將‘云茄3號’與其它6個茄子雜交品種區分開來. 純度鑒定結果顯示,SSR分子標記檢測與田間植株純度鑒定結果一致,均達到了99%. 以上結果表明,在檢測種子純度方面,SSR分子標記與傳統的田間種植觀察相比有著簡單、高效的特點,可作為分子標記輔助手段,加快茄子優良品種的選育和推廣.

English Abstract

  • 茄子(Solanum melongena L.)屬于茄科(Solanaceae)茄屬(2n=24),原產于東南亞、印度,早在公元4—5世紀就傳入中國. 至今,我國已成為茄子種植面積最大,也是茄子種質資源保存最多的國家[1-2]. 近年來,茄子已成為我國主要蔬菜種類之一,在生產中占有重要地位.

    云南省茄子種植面積一直保持在1.67萬hm2 (25.0萬畝)左右. 除滇中、滇東北等大多數地區進行春夏栽培外,元謀、元江、賓川、華寧、開遠、西雙版納等氣候溫暖的低海拔河谷地區還可進行冬春錯季栽培,銷往省內外,成為外銷冬春早熟蔬菜的一大種類. 然而,由于各地消費習慣和生態氣候不同,茄子外引品種在云南栽培后往往不能適應云南低緯度高海拔氣候,從而不能表現出原有的優良性狀或外觀品質,不被當地消費者所接受. ‘云茄3號’由云南省農業科學院園藝作物研究所培育而成,該品種果實長條形,果長約34 cm,橫徑約5.3 cm. 果皮鮮紫色,有光澤,皮薄,果肉乳白色,肉質較松軟,單果質量約330 g,每畝產量5500 kg左右. ‘云茄3號’具有長勢強、果形好、品質優、豐產性好、較抗病等優良的綜合性狀,是云南省具有自主知識產權,適宜本地栽培的僅有的幾個茄子新品種之一[3].

    品種純度是種子的主要質量指標之一,影響作物的產量和品質;由于純度低而導致的減產會在一定程度上削弱一個新品種的潛力,從而造成巨大的經濟損失,因此,種子純度的鑒定在品種選育研究方面至關重要[4]. 然而,當前制約我國茄子產業經濟效益提高的關鍵問題之一就是選種問題,存在品種雜亂,常規種與雜交種混雜,外引種和地方品種并存,種子純度低且品質良莠不齊等問題,嚴重影響了農民收入,制約了茄子產業的可持續發展[5-6].

    目前,常用的種子純度鑒定方法有形態檢驗法、蛋白質電泳技術檢驗法、DNA分子標記技術檢驗法等. 其中,DNA分子標記技術檢測對象是種子的DNA片段,不受環境影響,有較高的準確性、穩定性和重復性而應用廣泛[7]. 簡單重復序列標記(simple sequence repeats, SSR)是一種以特異引物PCR為基礎的分子標記技術,也稱為微衛星DNA,是一類由幾個核苷酸(一般為1~6個)為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列. 與其它分子標記相比,SSR分子標記具有以下優勢:①大量、隨機地分布于整個基因組,多態性高;②呈孟德爾方式遺傳,共顯性,不易被自然選擇和人工選擇所淘汰;③僅需少量DNA即可進行PCR擴增,其產物通過電泳分析,操作簡便、分辨率高,PCR擴增的可重復性高;④在種屬間有良好的通用性;⑤SSR位點由設計的引物順序決定,便于相互交流,開發新引物;⑥一旦確定引物,結果穩定等. 因此,SSR分子標記技術已成為品種鑒定、申請和保護過程中研究應用的熱點[8-13].

    基于此,為了給茄子優良品種‘云茄3號’提供一種高效、快速的種子純度鑒定方法,加快其制種和推廣應用速度,本研究通過已知SSR引物,篩選出在親本中呈互補帶型的多態性引物,再在市場常見的茄子雜交品種中進行復篩,利用最終篩選出的引物對‘云茄3號’進行純度鑒定;同時,結合田間觀察結果進行準確度判斷. 本研究結果有助于保護茄子品種,加快優良品種的選育和推廣,并為以后的茄子育種研究奠定技術參考.

    • 試驗材料‘云茄3號’及其父母本E26×E268(資源編號),均為紫長茄類型,由云南省農業科學院園藝作物研究所提供. 6個昆明市場主要雜交茄子品種,‘火金剛’、‘長豐2號’、‘昆明紫長茄’、‘長豐3號’、‘紅秀’、‘云茄6號’,屬紫長茄類型,購自云南省昆明市小板橋種子交易市場,均為目前市場上主要種植的紫長茄雜交茄子品種.

      以上茄子材料均在2019年3月種植于云南省農業科學院嵩明基地,待幼苗有4~6片真葉時,隨機選‘云茄3號’100株,其它材料各20株,取葉片依次編號后–80 ℃保存備用. 用于田間鑒定的茄子材料對應前面DNA編號進行編號,掛牌后種植于大田中進行常規管理.

      備篩的66對SSR引物選自李懷志、王利英等人[14-18]公開發表的SSR標記引物.

    • 茄子基因組DNA的制備使用DNA提取純化試劑盒(康寧生命科學(吳江)有限公司),按照相應說明書進行提??;應用NanoDrop2000超微量核酸蛋白分析儀對DNA樣品進行濃度和純度檢測.

    • 通過溫度梯度PCR設置不同退火溫度,對不同引物的適宜退火溫度進行摸索,根據摸索結果將66對引物分為4個退火溫度(55、58、61、63 ℃)類型,按以下反應體系和程序,在BIO-RAD thermal cycle PCR儀上進行擴增.

      SSR-PCR反應體系(20 μL):10 μL 2 × Taq Plus Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司),DNA模板1 μL,正反引物各1 μL,7 μL ddH2O.

      擴增程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃/58 ℃/61 ℃/63 ℃退火40 s;72 ℃延伸85 s,30次循環;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存.

    • 將擴增產物應用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠在雙向垂直電泳槽(北京六一)上180 V電泳90 min;每孔點樣2 μL,DNA Marker使用50 bp plus DNA Ladder(北京酷來搏科技有限公司). 電泳結束后,將膠塊輕輕取下后在固定液(0.02%冰醋酸和99%酒精混合液)中浸泡10 min,取出后,ddH2O沖洗1次,再在0.1% AgNO3溶液中銀染10 min,取出后,再用ddH2O快速沖洗2次,隨后浸泡于顯影液(3% NaOH和0.5%甲醛混合液)中顯影,至可以觀察到DNA條帶后立即用ddH2O漂洗,平鋪在觀察燈上觀察、拍照并編號保存.

    • 應用66對備篩引物,對‘云茄3號’及其父母本進行特異條帶篩選. 根據電泳結果,篩選出條帶清晰、多態性好的共顯性標記,用于后續市場常見茄子品種檢測和雜交種‘云茄3號’的純度鑒定.

    • 將篩選出的共顯性引物對目前市場常見的雜交茄品種進行電泳,從中篩選出能夠將‘云茄3號’與其它品種區分開的特異性引物,用于下一步的純度鑒定中.

    • 將篩選出的多態性好且能夠將‘云茄3號’與其它常見品種區分開的共顯性標記引物在‘云茄3號’的100個單株里進行檢測,并拍照、記錄.

    • 將大田中與DNA編號一致的100株‘云茄3號’單株,在盛果期進行性狀調查,通過比較株型、葉型、果型、果色、萼片色等表型性狀對群體進行純度鑒定,并與SSR純度鑒定結果進行對比.

    • 提取的茄子基因組DNA, 經0.8% 瓊脂糖電泳檢測,可見條帶清晰 ,無拖帶(圖1). DNA檢測結果顯示,A260/A280值介于1.8~2.0之間,表明提取的DNA質量較好,符合以后試驗的要求;DNA質量濃度介于50~100 ng/μL之間,統一稀釋至50 ng/μL.

      圖  1  茄子基因組DNA條帶

      Figure 1.  DNA bands of eggplant genome

    • 將查閱文獻所得的66對備選引物在適宜的退火溫度下擴增親本條帶,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,尋找到4對擴增條帶清晰的多態性引物(表1). 再將父母本與雜交種同時在4對多態性引物擴增下檢測,確定出了2對在雜交茄‘云茄3號’及其親本中多態性條帶清晰、穩定性好的引物SM17和SM29(圖2).

      引物名稱正向引物序列(5′-3′)反向引物序列(5′-3′)
      SM17ATCAATGACACCCAAAACCCATTTGTTTGAAAACCCAATACAAATCCGA
      SM29ATTGTGTCGATGAGATTTTGGTCAGTTTAGCTACGTTGGTTTGGTGCTGAA
      SSR174ATTGGTGAACGATGATCCTGAATGGTTTAGAGAATGGGATGAGATTGCTTCG
      SSR199ATCAAATGGGAGAAAATACTGCATCGTTTGGCTTAAACACACAACGTATATGGAC

      表 1  SSR多態性引物序列

      Table 1.  The primer sequences of polymorphic SSR

      圖  2  ‘云茄3號’及其親本SSR譜帶類型比較

      Figure 2.  Comparison on SSR band types between ‘Yunqie No.3’ and its parents

      應用這2對引物對市場上常見的6個紫長茄雜交種中進行檢測,結果表明,SM17和SM29均可將‘云茄3號’與其它品種區分開來,可以用于下一步‘云茄3號’的純度檢測(圖3).

      圖  3  引物SM17和SM29在7個紫長茄雜交品種中的擴增表現

      Figure 3.  The SSR amplification results of primer SM17 and primer SM29 in 7 eggplant cultivars

    • 通過提取‘云茄3號’單株的DNA,共獲得100份樣品并依次編號. 將篩選出的兩對在親本中呈共顯性條帶的引物SM17和SM29,分別對上述100份樣品進行純度檢測,結果如圖4、5所示. 引物SM17檢測結果(圖4)顯示,在100份樣品中,36號單株表現為母本型條帶,其它條帶為雜合型,表明該單株為偏母本的雜株,剩下99株為純合F1代,引物SM17檢測出的‘云茄3號’種子純度為99%. 引物SM29擴增產物檢測結果(圖5)表明,100份樣品中的同樣編號出現了1個母本型條帶,其它條帶則完全一致,表明引物SM29檢測出的‘云茄3號’種子純度與引物SM17檢測結果一致,純度也為99%.

      圖  4  引物SM17對茄子雜交種‘云茄3號’群體純度鑒定的SSR部分擴增結果

      Figure 4.  The partial SSR amplification results of primer SM17 for purity identification in ‘Yunqie No.3’ hybrid population

      圖  5  引物SM29對茄子雜交種‘云茄3號’群體純度鑒定的SSR部分擴增結果

      Figure 5.  The partial SSR amplification results of primer SM29 for purity identification in ‘Yunqie No.3’ hybrid population

    • 在大田中種植的20株父母本與100株‘云茄3號’(圖6)均存活. 當茄子盛果期時統一進行性狀調查,通過比較株型、葉型、果型、果色、萼片色等表型性狀對群體進行純度鑒定. 檢測出偏母本的雜株1株,且編號與DNA樣品一致均為36號. 因此,其田間純度檢測結果為99%. 這與SSR分子標記技術檢測的結果一致,說明SSR技術能夠用于茄子F1代種子純度的快速檢測.

      圖  6  茄子雜交種‘云茄3號’田間調查結果

      Figure 6.  Field properties investigation for ‘Yunqie No.3’ hybrid

    • SSR分子標記在茄子中的應用,國內外均有報道[19-22]. 然而,由于茄子遠緣雜交不親和,幾乎所有的商業品種都由栽培茄自交系配組而成,從而使得栽培種之間的親緣關系普遍較近,很難找到在雙親中存在差異且在雜一代中呈現共顯性的SSR標記. 張敏等[16]利用SSR技術對‘鄂茄子2號’的雜種一代群體進行純度鑒定,從100對引物中篩選出了3對特異性引物;王利英等[15]用已有的236對SSR引物對3個茄子品種進行多態性標記分析,僅篩選出15對多態性引物用于3個品種的純度鑒定;潛宗偉等[23]為了鑒定茄子雜交種‘京茄218’的純度,從152對SSR引物中篩選出2對引物的擴增條帶在‘京茄218’中呈現父母本互補帶型;王艷娜等[24]在124對SSR引物中篩選出15對多態性引物來鑒定茄子雜種F1純度. 然而,目前篩選出的茄子SSR多態性引物與其它作物相比仍較少,且不同品種的多態標記也會隨之不同,因此,針對‘云茄3號’有必要重新進行SSR標記的篩選.

      本研究從已發表的文獻中篩選出66對SSR引物,將其應用于‘云茄3號’和父母本材料進行多樣性引物篩選,篩選出4對多態性引物,多態性引物的比例為6.06%. 最終,從中僅篩選出2對條帶清晰、穩定性好、呈互補帶型的SSR引物,可見其利用率相當低. 此外,父母本之間的差異條帶大部分不位于條帶清晰的主條帶,而在副條帶(大小為200~300 bp)不容易觀察,由此可見茄子種子純度鑒定中SSR引物篩選的難度比較高. 通過檢測,篩選出的2對共顯性引物(SM17和SM29)均可將‘云茄3號’與其它品種區分開來,表明其為有效引物. SM17和SM29對‘云茄3號’的100個單株進行純度檢測,兩者檢測結果一致且與田間調查結果相吻合,雜交種‘云茄3號’的純度為99%,且發現群體中唯一的1株雜株為母本混雜引起的,可能是由于人為操作,如人工去雄不徹底或母本種子混入造成.

      以上表明,引物SM17和SM29可用于茄子雜交種‘云茄3號’的種子純度SSR分子鑒定,并驗證了SSR技術應用于種子純度鑒定的高效、快速、準確等優點. 然而,此技術前期合成新的SSR引物費時耗力,并且成本高,使得SSR技術在實際運用中受到了一定的限制[15]. 不過,隨著茄子基因組的不斷完善[25]和研究者的不斷挖掘,更多的SSR位點將被標記出來,進而開發成本也會降低. 新的分子標記技術也在不斷涌現,分子標記輔助育種在茄子新品種選育和保護上的應用將更加廣泛.

參考文獻 (25)

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