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基于分子動力學模擬和自由能計算的非小細胞肺癌對克唑替尼(crizotinib)耐藥性研究

桑鵬 李智 楊力權 宋玲

引用本文:
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基于分子動力學模擬和自由能計算的非小細胞肺癌對克唑替尼(crizotinib)耐藥性研究

    作者簡介: ?!※i(1983– ),男,山東人,博士,講師,主要從事結構生物信息學方面的研究. E-mail:speng431@163.com;
    通訊作者: 宋玲, songl0870@yeah.net

Insight into crizotinib resistance of non-small cell lung cancer derived from molecular dynamics simulations and free energy analysis

    Corresponding author: SONG Ling, songl0870@yeah.net
  • 摘要: 為了研究間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)F1174V突變引起非小細胞肺癌患者對crizotinib的耐藥性機制,使用分子動力學模擬(molecular dynamics simulations, MD). 本質動力學(essential dynamics, ED)分析及分子力學泊松-玻爾茲曼比表面積(molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area, MM-PBSA)結合自由能計算等方法研究了野生型及F1174V突變型ALK與克唑替尼(crizotinib)結合模式的差異. MD模擬和ED分析結果表明,F1174V突變導致ALK的crizotinib結合口袋部位構象柔性降低,由此可能造成藥物進出ALK速度減慢,影響藥物發揮正常作用. MM-PBSA結合自由能計算結果表明,F1174V突變造成ALK與crizotinib的結合能力降低. 進一步構建了野生型和突變型ALK的自由能圖譜(free energy landscape,FEL),并選取了二者最主要自由能井的代表性結構進行比較. 結果表明,F1174V突變可以顯著改變ALK的構象,特別是可以通過收縮P-環和縮小結合口袋來減弱其與crizotinib的相互作用. 研究有助于揭示基于ALK的靶向藥物耐藥機制,并為開發抗非小細胞肺癌藥物提供幫助.
  • 圖 1  模擬過程中ALK野生型和突變型骨架原子相對初始結構的RMSD值

    Figure 1.  The RMSD values of backbone atoms from the initial structures of WT and mutant ALK during simulation

    圖 2  野生型和突變體殘基在模擬過程中的RMSF值

    Figure 2.  The RMSF value of each residue of WT and mutant during the simulation

    圖 3  野生型和突變體前20個本征向量對應的本征值

    Figure 3.  Eigenvalues as a function of the first 20 eigenvectors of WT and mutant

    圖 4  野生型和突變體ALK的FEL及自由能最小化區域的代表性結構.自由能圖譜通過主成分分析方法進行構建,其中野生型和突變體的分子結構用 Pymoe軟件[28]作圖,ALK和crizontinib分子之間的相互作用由Ligplot軟件[29]進行分析.

    Figure 4.  FEL and the representative structure in the lowest energy basin. The FEL were constructed based on the principal component analysis. The surface and cartoon representation of crizotinib were generated by Pymol[28]. Residue interations in the ALK-crizotinib interface was analyzed by Ligplot[29].

    表 1  組成crizotinib結合部位的殘基RMSF值

    Table 1.  RMSF values of the crizotinib binding sites

    殘基均方根波動/nm
    野生型突變型
    11220.23460.2108
    11300.24420.0967
    11480.26150.1123
    11970.20960.0911
    11980.25030.2442
    11990.18100.1784
    12560.22190.2087
    下載: 導出CSV

    表 2  野生型和突變體ALK在模擬過程中的幾何屬性

    Table 2.  Structural properties of the WT and mutant of ALK

    蛋白質NNCNHBRg/nmSASA/nm2
    野生型334530 (1094)227 (7.6)1.96 (0.02) 140.82 (2.82)
    突變型340622 (1125)232 (7.5)1.94 (0.01)135.26(2.75)
    下載: 導出CSV

    表 3  野生型和突變體ALK與crizotinib之間的結合自由能

    Table 3.  Binding free energy and its components of the WT and mutant kJ/mol

    結合自由能組分野生型突變型
    ΔEvdw ?41.52 ?39.56
    ΔEele ?242.37 ?211.05
    ΔGpolar 173.42 165.31
    ΔGnonpolar ?8.76 ?4.35
    ΔGMM ?283.89 ?250.61
    ΔGsol 164.66 160.96
    ΔG ?119.23 ?89.65
    ?TΔS 24.85 19.36
    ΔGbind ?94.38 ?70.29
    下載: 導出CSV
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出版歷程
  • 收稿日期:  2020-01-04
  • 錄用日期:  2020-05-15
  • 網絡出版日期:  2020-06-23
  • 刊出日期:  2020-07-01

基于分子動力學模擬和自由能計算的非小細胞肺癌對克唑替尼(crizotinib)耐藥性研究

    作者簡介:?!※i(1983– ),男,山東人,博士,講師,主要從事結構生物信息學方面的研究. E-mail:speng431@163.com
    通訊作者: 宋玲, songl0870@yeah.net
  • 1. 大理大學 農學與生物科學學院,云南 大理 671003
  • 2. 昭通衛生職業學院,云南 昭通 657000

摘要: 為了研究間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)F1174V突變引起非小細胞肺癌患者對crizotinib的耐藥性機制,使用分子動力學模擬(molecular dynamics simulations, MD). 本質動力學(essential dynamics, ED)分析及分子力學泊松-玻爾茲曼比表面積(molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area, MM-PBSA)結合自由能計算等方法研究了野生型及F1174V突變型ALK與克唑替尼(crizotinib)結合模式的差異. MD模擬和ED分析結果表明,F1174V突變導致ALK的crizotinib結合口袋部位構象柔性降低,由此可能造成藥物進出ALK速度減慢,影響藥物發揮正常作用. MM-PBSA結合自由能計算結果表明,F1174V突變造成ALK與crizotinib的結合能力降低. 進一步構建了野生型和突變型ALK的自由能圖譜(free energy landscape,FEL),并選取了二者最主要自由能井的代表性結構進行比較. 結果表明,F1174V突變可以顯著改變ALK的構象,特別是可以通過收縮P-環和縮小結合口袋來減弱其與crizotinib的相互作用. 研究有助于揭示基于ALK的靶向藥物耐藥機制,并為開發抗非小細胞肺癌藥物提供幫助.

English Abstract

  • 肺癌是威脅人類健康的主要疾病,可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)兩種類型,而后者可占全世界肺癌死亡人數的85%左右[1-3]. 目前研究表明,間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)的重排是除表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)激活外另一引起非小細胞肺癌的重要原因. 因此,ALK成為了目前研發抗非小細胞肺癌藥物的重要靶點.

    ALK是一種細胞質酪氨酸蛋白激酶,主要在中樞和外周神經系統中表達[4-5]. ALK屬于胰島素受體超家族成員,其與包括糖尿病和癌癥在內的多種疾病相關. 與大多數蛋白激酶類似,ALK的結構采取了一種雙葉折疊的模式,即包括了一個較小的氮末端葉(N-lobe)結構域和一個較大的碳末端葉(C-lobe)結構域. 以上兩個結構域通過一個較小的環區相連接,該環區同時也是ALK與ATP分子及其他競爭性抑制劑進行結合的口袋. N-lobe結構域由5個反平行β-折疊及相鄰的1個α-螺旋構成,而C-lobe則主要由α-螺旋所構成[5-6]. 研究表明,ALK基因可發生染色體重排并引起ALK融合基因的表達,而后者可以使ALK蛋白發生非配體依賴性的聚合導致其一直處于激活狀態,從而引發包括非小細胞肺癌和大細胞淋巴瘤在內的多種癌癥[5, 7]. 因此,有效抑制ALK的活性成為一種新的治療非小細胞肺癌方式. 克唑替尼(crizotinib)是被發現的一種可以高效抑制ALK活性的化合物,并且很快被美國FDA批準為治療非小細胞肺癌的藥物而被廣泛使用[8]. 雖然crizotinib在治療ALK相關的非小細胞肺癌時療效顯著,但較好的療效會隨著腫瘤耐藥性的產生而迅速減弱[9]. 研究表明,大約三分之一的ALK相關非小細胞肺癌患者在使用crizotinib 12個月內都會出現耐藥性,從而會導致癌癥的復發[5]. 因此,耐藥性的產生已經成為制約開發ALK抑制劑和靶向藥物的主要障礙[7]. 目前,人們已經在發生crizotinib耐藥性的病人ALK基因上發現了多個突變,在這些突變中最為常見的是L1196M 和 G1269A突變,而且這兩種突變的空間位阻耐藥機制已經研究得相對比較清楚[7].

    Ou等在非小細胞肺癌患者中發現了另一種crizotinib耐藥性ALK突變F1174V[10]. 與常見的L1196M 和 G1269A突變不同,F1174V突變導致crizotinib耐藥性的機制仍不清楚. 為了揭示F1174V突變對ALK蛋白結構和動力學性質以及其與crizotinib相互作用的影響,我們分別使用了MD模擬,ED分析,MM-PBSA結合自由能計算以及FEL構建等方法對野生型和F1174V突變型ALK- crizotinib復合物進行了比較研究. 研究在蛋白質原子結構水平上揭示了突變是如何影響ALK與crizotinib相互作用的,并為突變導致的crizotinib耐藥性機制提供合理解釋.

    • 野生型ALK-crizotinib復合物三維空間結構下載自PDB蛋白質結構數據庫(PDB檢索號:2XP2[11]). 使用MODELLER軟件包通過同源模建技術構建F1174V突變型ALK-crizotinib復合物三維空間模型[12]. 使用分子概率密度函數對所構建的結構進性評估,選擇函數值最小的結構作為最終的突變體結構模型.

    • MD模擬及分子力學優化用GROMACS軟件完成[13],選擇的力場為Amber03[14-15]. Crizotinib的力場由PRODRG 2.5產生[16]. MD模擬之前,將能量最小化的ALK-crizotinib復合物野生型和突變體結構模型置于包含周期邊界條件的立方體盒子中央,并保證蛋白質的每個原子與盒子壁的距離不小于1.1 nm. 之后,向盒子中加入TIP3P水分子[17]. 隨后分別使用最陡下降法和共軛梯度法對系統進行能量最小化處理. 在MD模擬之前,對野生型和突變體模擬系統分別進行了100 ps的位置限制性模擬以促使水分子充分浸潤蛋白質分子. 最后對兩個模擬體系分別進行100 ns的生產MD模擬.

      MD模擬的詳細參數如下:積分時間步長為2 fs;質量中心平移和旋轉的消除頻率為1步/次;非鍵相互作用的更新頻率為10步/次;靜電相互作用采用PME(Partial-Mesh Ewald)算法[18],其內插階(interpolation order)設為4;傅立葉空間(Fourierspacing)和庫侖(Coulomb)半徑分別設為0.135 nm和1.0 nm;范德華(van der Waals,VDW)相互作用的截斷半徑為1.4 nm;蛋白質和非蛋白質組分(如溶劑和離子)的熱浴溫度均為300 K,耦合時間常數τ_t設為0.1 ps;系統壓強為1 atm,耦合時間常數τ_p設為0.5 ps;原子的初始速度根據300 K條件下的麥克斯韋分布隨機產生;用階次(order)為4的LINCS算法[19]將鍵長約束在它們的平衡位置附近;記錄結構框架的頻率為10 ps/次. 模擬過程中的均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)和均方根波動(root mean square fluctuation, RMSF)分別由GROMACS軟件包中的g_rms和g_rmsf進行計算.

    • 野生型和突變體ALK-crizotinib復合物在模擬過程中的各種幾何性質,如氫鍵數量(NHB)、溶劑可及性表面面積(SASA)、范德華接觸數量(NNC)、分子回旋半徑(Rg)分別由GROMACS軟件包中g_hbond,g_sas, g_mindist, g_gyrate 等程序進行計算.

    • ED分析的基本原理及詳細過程可以參考文獻[20]. 使用GROMACS軟件包中的g_covar程序構建野生型和突變型模擬體系的Cα原子協方差矩陣并進行對角線化,進一步使用g_anaeig程序將動力學模擬軌跡投射到對應的本征向量上進行ED分析.

      FEL可以用來表征一個模擬體系蛋白質的動態變化過程[21]. 利用ED分析的結果分別對野生型和突變型ALK模擬體系進行FEL構建. 自由能的計算公式為:

      $ \Delta G\left( X \right) = - {K_{\rm{B}}}T\; \ln P\left( X \right), $

      其中反應坐標X代表模擬軌跡在某個本征向量上的投射,KB代表玻爾茲曼常數,T代表系統的溫度,P(X)代表某個本征向量上的構象分布概率. 在本研究中,最終的FEL由SigmaPlot軟件作圖顯示. 為了得到每個自由能井的代表性結構,我們對自由能井里的所有構象根據RMSD值進行聚類分析,其中聚類的閾值為0.2 nm,使用每一個聚類的中間結構作為代表性結構.

    • 目前最為廣泛使用的結合自由能算法為MM-PBSA算法[22]. 該算法通過對組成結合自由能的各組分進行分解和計算,可以為解析復合物分子之間復雜的相互作用過程提供幫助[23-24]. 在本研究中,野生型和突變體ALK 與crizotinib的結合自由能使用GROMACS軟件包的插件g_mmpbsa程序來完成[25]. 在MM-PBSA算法中,結合自由能定義為[23, 25-26]:

      $ \Delta {G_{{\rm{binding}}}} = \Delta {G_{{\rm{complex}}}} - \left( {\Delta {G_{{\rm{protein}}}} + \Delta {G_{{\rm{ligand}}}}} \right), $

      其中ΔGcomplex, ΔGprotein 和 ΔGligand分別代表蛋白質–配體復合物,蛋白質及配體三者各自在溶劑環境中的總自由能. 對于上式中的每個組分,即自由能G,可以表示為:

      $ G = {E_{{\rm{MM}}}} + {G_{{\rm{sol}}}} - TS, $

      其中EMM代表在真空中的分子力學勢能,Gsol定義了溶解自由能. TS代表自由能中的熵貢獻部分,其中T代表溫度,S代表熵. EMM包括了鍵作用和非鍵相互作用兩類,即鍵角,二面角,靜電相互作用(Eelec)及范德華相互作用(Evdw). 由于在單軌跡方法中鍵作用的貢獻默認為0,因此g_mmpbsa在計算結合自由能時只計算EMM部分,即靜電相互作用和范德華相互作用部分,即

      $ {E_{{\rm{MM}}}} = {E_{{\rm{ele}}}} + {E_{{\rm{vdw}}}}. $

      溶解自由能包括極性部分(Gpolar)和非極性部分(Gnonpolar),即:

      $ {G_{{\rm{solvation}}}} = {G_{{\rm{polar}}}} + {G_{{\rm{nonpolar}}}}. $

      雖然g_mmpbsa計算的結合自由能只是相對自由能,但這個軟件還是非常適合比較配體在與不同蛋白受體結合時的自由能差異的. 本研究使用20~100 ns的模擬軌跡用于結合自由能的計算,其中每100 ps取出1個結構快照,即共使用800個結構快照用于結合自由能計算.

    • ALK-crizotinib復合物在模擬過程中的結構穩定性由隨時間變化的碳骨架RMSD值來表征(圖1). 如圖1,對于野生型和突變體兩個模擬系統,它們的RMSD值在模擬的前20 ns均有一個快速上升的過程,然后則變得較為平穩,因此我們選取最后80 ns模擬軌跡用于后續的結構屬性分析.

      圖  1  模擬過程中ALK野生型和突變型骨架原子相對初始結構的RMSD值

      Figure 1.  The RMSD values of backbone atoms from the initial structures of WT and mutant ALK during simulation

      為了比較野生型和突變體ALK-crizotinib復合物在模擬過程中構象柔性上的差異,我們計算了ALK各個殘基在模擬過程中的RMSF值. 圖2顯示了以殘基序號為函數的野生型和突變體ALK-crizotinib復合物分子的RMSF值. 由圖2可以看出,除了數量有限的區域之外,突變體ALK在整體上比野生型蛋白具有更低的柔性(或更高的剛性). 野生型和突變體ALK所有殘基RMSF的平均值分別為0.195,0.158 nm. 進一步觀察圖2顯示突變體結構柔性顯著降低的區域主要集中于暴露于蛋白分子表面的一些外部環區,特別是crizotinib的結合口袋區域. 例如,F1174V突變導致ALK構象柔性降低的區域包括殘基1121~1129, 1135~1145, 1187~1192 及1197~1203. 在這些區域中,殘基1121~1129區域是富含甘氨酸的環區(P-loop),且組成了crizotinib結合口袋的一部分,而殘基1197~1203則組成了結合口袋的另外一部分.

      圖  2  野生型和突變體殘基在模擬過程中的RMSF值

      Figure 2.  The RMSF value of each residue of WT and mutant during the simulation

      為了研究F1174V突變對crizotinib結合部位構象柔性的影響,我們比較了野生型和突變體ALK在相應殘基位置上的RMSF差異. 如表1所示,與野生型相比,所有組成突變體crizotinib結合口袋的殘基RMSF值均降低.

      殘基均方根波動/nm
      野生型突變型
      11220.23460.2108
      11300.24420.0967
      11480.26150.1123
      11970.20960.0911
      11980.25030.2442
      11990.18100.1784
      12560.22190.2087

      表 1  組成crizotinib結合部位的殘基RMSF值

      Table 1.  RMSF values of the crizotinib binding sites

      研究表明,蛋白質柔性在其發揮生物學功能時起著至關重要的作用[27]. 例如,較高的柔性會導致蛋白質底物結合口袋增大,因此有利于底物的進出. 另外,蛋白質構象柔性的增加也有利于提高其與底物的結合能力. 因此,F1174V突變導致的蛋白整體構象柔性特別是crizotinib結合部位構象柔性的降低,可能會影響ALK與crizotinib的相互作用.

      蛋白質構象柔性的降低往往是由于分子內部一些原子間相互作用及非鍵相互作用的增強所致的. 為了探究突變造成ALK蛋白構象柔性降低的原因,使用兩個模擬系統的模擬平衡軌跡部分計算了ALK的各種動態幾何屬性. 表2描述了在模擬過程中野生型和突變體ALK各種動態幾何屬性的差異. 這些比較的幾何屬性包括氫鍵數量(Number of the H-bonds, NHB)、溶劑可及性表面面積(Solvent accessible surface area, SASA)、范德華接觸的數量(Number of native contacts, NNC)以及旋轉半徑(Radius of gyration, Rg). 由表2可知,F1174V突變體比野生型ALK具有更多的NHB和NNC,但是具有較小的Rg和SASA,由此表明突變體比野生型ALK具有更多分子內相互作用以及更加緊密的結構包裝.

      蛋白質NNCNHBRg/nmSASA/nm2
      野生型334530 (1094)227 (7.6)1.96 (0.02) 140.82 (2.82)
      突變型340622 (1125)232 (7.5)1.94 (0.01)135.26(2.75)

      表 2  野生型和突變體ALK在模擬過程中的幾何屬性

      Table 2.  Structural properties of the WT and mutant of ALK

    • 野生型和突變體ALK模擬軌跡的本質動力學分析表明只有極少數本征向量具有顯著的本征值(圖3). 對角線化處理野生型,F1174V突變體的Cα原子協方差矩陣后,得到的總均方波動值(total mean square fluctuation, TMSF)分別為5.71和 4.81 nm2,表明野生型ALK在模擬過程中經歷了更大的構象波動. 此外,野生型ALK的前6個本征向量的本征值明顯高于突變體對應的本征值(圖3).

      圖  3  野生型和突變體前20個本征向量對應的本征值

      Figure 3.  Eigenvalues as a function of the first 20 eigenvectors of WT and mutant

      為了進一步比較野生型和突變體ALK在模擬過程中可以采到的構象空間大小,我們使用模擬軌跡在第1個本征向量(PC1)和第2個本征向量(PC2)的投射構建了二者的FEL(圖4). 另外,為了研究F1174V突變對ALK結構的影響,我們使用聚類的方法分別抽提了野生型和突變體FEL中最主要自由能阱的代表性結構,并進行了詳細的比較. 如圖4所示,野生型ALK的FEL相比F1174V突變體更加寬闊,而且具有更少的自由能最小化區域,由此可以說明野生型ALK在模擬過程中相比突變體采集到了更加豐富構象空間.

      圖  4  野生型和突變體ALK的FEL及自由能最小化區域的代表性結構.自由能圖譜通過主成分分析方法進行構建,其中野生型和突變體的分子結構用 Pymoe軟件[28]作圖,ALK和crizontinib分子之間的相互作用由Ligplot軟件[29]進行分析.

      Figure 4.  FEL and the representative structure in the lowest energy basin. The FEL were constructed based on the principal component analysis. The surface and cartoon representation of crizotinib were generated by Pymol[28]. Residue interations in the ALK-crizotinib interface was analyzed by Ligplot[29].

      為了探究構象柔性降低對ALK和crizotinib之間相互作用的影響,提取了野生型和突變體模擬系統的代表性結構,并進行比較. 野生型和F1174V突變體ALK與crizotinib之間的結合模式如圖4所示. 對于野生型來講,crizotinib的結合口袋大而寬闊,且存在5個相互作用殘基和1對氫鍵. 對于圖4進一步觀察表明野生型ALK的P-loop采取了更加開放和伸展的構象. 與此相反,突變體ALK的crizotinib結合口袋小而狹窄,并且只存在3個相互作用殘基,且并不存在氫鍵. 另外,突變體ALK采取了更加封閉和緊縮的構象. 突變體與crizotinib之間數量較少的相互作用殘基以及氫鍵的缺失可能會降低二者之間的作用力,且較狹窄的結合口袋及更加封閉和緊縮的P-loop構象也不利于crizotinib進出ALK分子. 由此可以推測,ALK在發生F1174V突變后會顯著減弱其與crizotinib的相互作用.

    • 為了定量描述F1174V突變對ALK與crizotinib之間相互作用的影響,我們使用MM-PBSA算法計算了二者之間的結合自由能,并詳細解析了各自由能組成成分的差異. 如表3所示,野生型和突變體ALK與crizotinib之間的結合自由能分別為?94.38 kJ/mol和?70.29 kJ/mol,表明crizotinib與野生型結合的更加緊密,因此F1174V突變發生不利于ALK與crizotinib之間的結合. 進一步對結合自由能進行詳細的分解表明,驅動ALK與crizotinib結合的主要作用力是真空中的勢能(ΔGMM)和非極性的溶解自由能(ΔGnonpolar). 對于野生型ALK-crizotinib復合物,ΔGMM和ΔGnonpolar分別為?283.89和?8.76 kJ/mol,而對于突變型ΔGMM和ΔGnonpolar則分別為?250.61和?4.35 kJ/mol. 因此,ALK突變后會導致驅動其與crizotinib相互作用的作用力ΔGMM和ΔGnonpolar均降低. 與ΔGMM和ΔGnonpolar對ALK與crizotinib之間的結合自由能正貢獻相反,極性的溶解自由能(ΔGpolar)和熵作用(?TΔS)均不利于ALK與crizotinib之間的結合. 對于野生型ALK-crizotinib復合物,ΔGpolar和?TΔS分別為173.42 kJ/mol和24.85 kJ/mol,而對于突變型ΔGpolar和?TΔS則分別為165.31 kJ/mol和19.36 kJ/mol. 值得注意的是,雖然突變型ALK較低的ΔGpolar和?TΔS值對于其與crizotinib之間的結合自由能負貢獻更小,然而由于野生型ALK與crizotinib之間結合時具有更低的ΔGMM和ΔGnonpolar值,因此使其最終的結合自由能低于突變型,即ALK發生F1174V突變后會使其與crizotinib的結合能力降低,從而可能導致耐藥性的產生.

      結合自由能組分野生型突變型
      ΔEvdw ?41.52 ?39.56
      ΔEele ?242.37 ?211.05
      ΔGpolar 173.42 165.31
      ΔGnonpolar ?8.76 ?4.35
      ΔGMM ?283.89 ?250.61
      ΔGsol 164.66 160.96
      ΔG ?119.23 ?89.65
      ?TΔS 24.85 19.36
      ΔGbind ?94.38 ?70.29

      表 3  野生型和突變體ALK與crizotinib之間的結合自由能

      Table 3.  Binding free energy and its components of the WT and mutant kJ/mol

    • 蛋白質氨基酸序列的變異往往會對其結構、動力學性質及功能產生重要的影響[30],特別是對于藥物分子的靶蛋白來講,錯義突變的出現往往預示著其耐藥性的產生. 為了研究F1174V突變影響ALK與crizotinib之間相互作用及產生耐藥性的機制,分別對野生型和F1174V突變型ALK-crizotinib復合物進行了MD模擬,ED分析及MM-PBSA結合自由能計算比較研究.

      通過對MD模擬軌跡進行結構穩定性和構象柔性分析并結合ED分析結果表明,F1174V突變型ALK結構相比野生型更加緊湊,且剛性更強. 進一步對組成crizotinib結合口袋的氨基酸殘基分析表明,突變型ALK中所有對應的殘基柔性均有所降低. 為了探究ALK在發生F1174V突變后蛋白質構象柔性降低的原因,分別計算了野生型和突變型ALK的各種分子內相互作用,結果表明ALK在發生突變后氫鍵數量及范德華接觸數量等表征分子間相互作用強弱的指標均有所增加,進而導致ALK分子的構象柔性降低.

      目前研究表明,蛋白質功能的發揮依賴于其動力學性質及構象柔性[31]. 較高的構象柔性可以使蛋白質能夠以不同的構象狀態存在,例如可以很容易實現底物結合口袋的舒張,使底物可以更方便地進出結合口袋,從而提高了與底物結合的效率[32]. 另外,現有研究表明蛋白質構象柔性的增加也可以增強其與底物之間的相互作用,進而使二者之間的結合能力增強[33]. 使用計算生物學的方法對野生型和F1174V突變型ALK分別與crizotinib之間的相互作用進行了比較研究,研究結果表明ALK在發生突變后構象柔性降低,并且與野生型相比具有更狹窄的crizotinib結合口袋,因此降低了ALK與crizotinib之間的結合效率. 另外,通過計算ALK與crizotinib之間的結合自由能表明,ALK在發生F1174V突變后導致其與crizotinib之間的結合自由能升高,因此結合能力降低. 綜上所述,研究結果從結構生物學信息學的角度證實了 F1174V突變發生后不利于ALK與crizotinib之間的相互作用,從而解釋了當非小細胞肺癌患者ALK蛋白發生F1174V突變后產生crizotinib耐藥性的機制.

參考文獻 (33)

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