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基于碳納米線圈的細胞應激性測試探針

王鵬

引用本文:
Citation:

基于碳納米線圈的細胞應激性測試探針

    通訊作者: 王鵬, WP15242630598@yeah.net
  • 中圖分類號: O756; Q256

Carbon nanocoil-based bioprobe for investigating cellular irritability

    Corresponding author: WANG Peng, WP15242630598@yeah.net
  • CLC number: O756; Q256

  • 摘要: 外界力、電刺激對細胞行為具有顯著影響,細胞的力、電應激特性研究廣受關注. 使用碳納米線圈對單個活體細胞定量施加局域力學和電學刺激,探究了細胞的應激特性. 研究發現碳納米線圈的局域力刺激可以引起細胞的整體響應,且受激響應程度與外力的作用形式和大小有關. 另外,細胞在碳納米線圈施加的局域電刺激下會產生顯著極性響應,并可在撤掉電刺激后逐漸恢復至初始狀態,表明其生理結構和功能未受到破壞. 基于碳納米線圈的非侵入性柔性生物探針具有安全可控、易操作和低成本等優點,在活體細胞對的應激和傳導機制研究、細胞行為調控等領域具有廣闊的應用前景.
  • 圖 1  碳納米線圈的掃描電子顯微鏡照片

    Figure 1.  The SEM image of CNC

    圖 2  已轉染熒光探針的骨肉瘤細胞的光學照片和熒光照片. (a)骨肉瘤細胞的低倍光學顯微照片. 同一視野下,骨肉瘤細胞的(b)光學照片及其(c)熒光供體基團和(d)受體基團的發光照片

    Figure 2.  The optical and fluorescent images of fluorescence-transfected U?20S cells. (a) Optical image of the U?20S cells. (b) Optical image, (c) Fluorescent image of ECFP and (d) Fluorescent image of YPet in the same field

    圖 3  碳納米線圈對骨肉瘤細胞施加力學刺激

    Figure 3.  Local mechanical stimulation on a single U?20S cell from a CNC

    圖 4  碳納米線圈對骨肉瘤細胞施加作用力時的熒光比變化曲線

    Figure 4.  The relationships between time and FRET ratio variation of a U?20S cell under mechanical stimulation from a CNC

    圖 5  碳納米線圈電極對骨肉瘤細胞施加電學刺激

    Figure 5.  Local electrical stimulation on a single cell from a CNC

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  • 加載中
圖(5)
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出版歷程
  • 收稿日期:  2020-02-15
  • 錄用日期:  2020-07-28
  • 網絡出版日期:  2020-08-04
  • 刊出日期:  2020-09-22

基于碳納米線圈的細胞應激性測試探針

摘要: 外界力、電刺激對細胞行為具有顯著影響,細胞的力、電應激特性研究廣受關注. 使用碳納米線圈對單個活體細胞定量施加局域力學和電學刺激,探究了細胞的應激特性. 研究發現碳納米線圈的局域力刺激可以引起細胞的整體響應,且受激響應程度與外力的作用形式和大小有關. 另外,細胞在碳納米線圈施加的局域電刺激下會產生顯著極性響應,并可在撤掉電刺激后逐漸恢復至初始狀態,表明其生理結構和功能未受到破壞. 基于碳納米線圈的非侵入性柔性生物探針具有安全可控、易操作和低成本等優點,在活體細胞對的應激和傳導機制研究、細胞行為調控等領域具有廣闊的應用前景.

English Abstract

  • 外界刺激,尤其是力、電等物理刺激對活體細胞的增殖、分化、遷移甚至是病變等行為具有顯著影響,因此細胞響應機制問題吸引了廣泛的關注和研究. 目前常見的細胞力學應激特性研究方法主要為化學方法和物理方法. 化學方法是利用化學藥物破壞細胞結構,例如細胞松弛素破壞肌動蛋白微絲[1],秋水仙素或諾考達唑破壞微管[2-3]等,通過細胞功能變化驗證被破壞部分的力學生理作用. 這種方法可能對細胞造成一定的副作用,難以準確定量地研究細胞應激特性變化. 物理方法是指對細胞直接施加作用力的方法,例如光鑷操控[4-5]、流體剪切力法[6-7]、直接牽拉培養基底[8-9]等. 然而,這些方法大多是對細胞整體施加力刺激,不僅難以對受刺激細胞進行準確的受力分析和定量研究,也不利于研究細胞的應激機制以及傳導機制.

    電學刺激對細胞行為同樣具有顯著影響. 前人的研究表明,外界電場的施加會明顯改變細胞的形狀和遷移方向[10-12]. 與傳統力學刺激方法一樣,細胞整體處于電場中也不利于電應激傳導機制的研究. 膜片鉗是目前最有效的細胞電學特性測試儀器之一,可以對細胞膜電位、單離子通道特性等細胞局域電學特性進行精確測量[13]. 然而膜片鉗儀器操作困難,破膜操作時容易導致細胞的死亡,降低了實驗的成功率. 因此,開發一種可以對細胞施加定量局域作用的、非侵入的、并且易于操作的生物探針對細胞力學、電學響應特性進行研究是必要的.

    由于天然的生物兼容性,碳納米材料,如石墨烯、碳納米管等,由于優異的力、電、光等特性而被廣泛用于生物領域,如抗菌治癌[14-15]、生物傳感與檢測[16-17]、生物體內成像[18-20]等. 但是,碳納米材料最顯著的特點是具有納米尺寸,在普通光學顯微鏡下難以直接觀察和操控,更難以用于對單細胞水平的受激響應測試. 利用碳納米管等碳納米材料制備成微生物電極陣列是近些年來出現的新方法,不僅可以調控細胞在基板上的附著位置,還能夠實現細胞遺傳物質的傳遞以及電學信號的測量[21-22]. 但這種微陣列的制備工藝復雜,耗時且成本較高. 因此如何低成本、簡便有效地利用碳納米材料直接對單活體細胞的應激性展開研究是必須解決的問題. 碳納米線圈(carbon nanocoil, CNC)是一種具有獨特螺旋結構的準一維納米材料,由于具有優異的力學和電學特性而被廣泛應用于微納機電系統[23-25]和可穿戴傳感器[26-28]等領域. 實際上,碳納米線圈在生物領域的應用具有很多優勢. 一般來說,碳納米線圈的長度約為幾十到100 μm,圈徑小于1 μm,可以直接在光學顯微鏡下進行觀察和精確操控. 由于較大的長徑比,碳納米線圈具有一定的柔性(橫向彎曲剛度約在10?5 N/m量級)[25],可以對細胞等微生物體非侵入性地定量地施加皮牛量級的局域作用力,便于進行受力分析,非常適合用于細胞水平的研究. 另外,碳納米線圈具有良好的導電特性,其電阻率約為10?4 Ω·m量級[29-30],也可以用于對細胞等微生物體施加電刺激或電學響應信號的檢測. 作為一種碳材料,碳納米線圈具有天然的生物兼容性[31]和化學惰性,可以用于生物方面的長時間檢測而不會發生損壞或降解變性. 因此碳納米線圈非常適合用于生物領域,特別是細胞水平的研究. 但是,目前還沒有利用碳納米線圈研究單細胞特性的相關報道.

    本研究利用碳納米線圈作為柔性生物探針,對骨肉瘤細胞施加了局域的力和電刺激,并基于熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)技術觀察了細胞的受激反應. 研究結果表明,碳納米線圈探針可以對細胞施加有效刺激并使細胞產生空間極性響應,并觀察到了細胞局域響應的擴散與傳導現象,為進一步研究細胞應激傳導機制提供了一種有效的研究手段.

    • 本研究中所使用的碳納米線圈是用鐵?錫?氧催化劑通過熱化學氣相沉積法制備的[32]. 用濃度為0.2 mol/L的Fe2(SO4)3·9H2O和SnCl2·5H2O的溶液作為催化劑前驅體,通過滴涂法將前驅體溶液擔載到石英基板上并在空氣中干燥45 min. 之后將基板放置在化學氣相反應爐中,在710 ℃下的氬氣保護環境中煅燒30 min,氬氣流量為6.1 mL/s. 煅燒完成后,向反應爐中通入乙炔和氬氣,流量分別為0.25 mL/s和5.4 mL/s,在710 ℃下沉積生長2 h,最終得到所需的碳納米線圈樣品. 用鎢絲針尖從制備的團簇樣品中抽取出單根碳納米線圈,無需二次處理即可直接作為生物柔性探針. 圖1展示了碳納米線圈的掃描電子顯微鏡圖片. 可以看到碳納米線圈整體呈準一維狀,同時具有獨特的亞微米尺度螺旋結構.

      圖  1  碳納米線圈的掃描電子顯微鏡照片

      Figure 1.  The SEM image of CNC

    • 本實驗中選用人骨肉瘤細胞(osteosarcoma cell, U?20S). 該細胞來源廣泛,易培養而不易死亡;細胞尺寸適宜,便于觀察和開展實驗.

      骨肉瘤細胞株由中科院上海細胞庫購得. 使用89%RPMI 1640緩沖液(HyClone, 美國),10%胎牛血清(Sigma?Aldrich, 美國)和1%的青霉素/鏈霉素溶液(Gibco, 美國)配制細胞培養基. 在此培養基中接種細胞,放入溫度為37 ℃,二氧化碳體積分數為5%的培養箱中. 圖2(a)展示了骨肉瘤細胞的光學照片,多數細胞呈不規則形狀,處于貼壁狀態,顯示細胞活性良好.

      圖  2  已轉染熒光探針的骨肉瘤細胞的光學照片和熒光照片. (a)骨肉瘤細胞的低倍光學顯微照片. 同一視野下,骨肉瘤細胞的(b)光學照片及其(c)熒光供體基團和(d)受體基團的發光照片

      Figure 2.  The optical and fluorescent images of fluorescence-transfected U?20S cells. (a) Optical image of the U?20S cells. (b) Optical image, (c) Fluorescent image of ECFP and (d) Fluorescent image of YPet in the same field

    • 利用FRET技術表征骨肉瘤細胞的受激響應特性. 通過基因工程技術將含有一個熒光供體基團和一個熒光受體基團的熒光探針植入到細胞當中,當細胞受到外界刺激做出響應時,供體與受體之間的距離會相應改變,二者的熒光發光強度將迅速發生變化,從而實現細胞反應的可視化顯示[33]. 本實驗用青色熒光增強蛋白(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP)作為熒光供體基團,其發射波長峰值為480 nm;用黃色熒光蛋白(yellow protein for energy transfer, YPet)作為熒光受體基團,其發射波長峰值為535 nm;激發光波長為440 nm.

    • 通過熒光顯微鏡(Olympus IX73, 日本)觀測細胞熒光變化情況. 圖2(b)(d)展示了同一視野中骨肉瘤細胞的明場照片,及其供體和受體基團的熒光照片. 由于細胞受到外界刺激前后熒光探針的供體基團和受體基團的發光強度會產生變化,因此可以采用熒光比(即供體與受體的發光強度比,I/I,FRET ratio)作為細胞應激特性的指標. 通過連續拍攝細胞的熒光照片,并使用Matlab軟件(MathWorks, 美國)對拍攝得到的熒光圖片進行處理,即可算得熒光比變化趨勢,進一步細胞的受激響應行為變化.

      當細胞受到力刺激時,細胞膜是最先感受到刺激并開始做出響應的. 將熒光探針定向表達在細胞膜上,2個熒光基團分別連接在細胞膜上的脂閾區域和非脂閾區域. 當細胞膜受外力而變形時,ECFP和YPet之間的距離會發生變化,從而引起熒光比變化. 因此,通過探測骨肉瘤細胞的熒光比變化可以分析細胞的力學應激反應.

      當細胞受到電刺激時,細胞膜上的離子通道會打開,導致培養基中的鈣離子進入細胞. 我們將熒光蛋白探針定向表達在對鈣離子較為敏感的CaM?M13蛋白上. 鈣離子濃度的升高會引起CaM?M13蛋白空間結構的變化而改變ECFP和YPet之間的距離,進而引起熒光比變化. 因此,通過探測骨肉瘤細胞的熒光比分析細胞內鈣離子擴散和傳播的行為,進一步分析細胞受到電學刺激時的應激反應.

    • 將單根碳納米線圈探針固定在三維微操作儀上,可以對碳納米線圈的位置實現微米級的精確調控,從而實現對骨肉瘤細胞定量施加局域作用力. 圖3(a)展示了碳納米線圈探針對U?20S細胞施加持續穩定橫向推力的光學照片,施加作用力的方向如白色箭頭所示. 碳納米線圈對細胞的作用力可通過下式進行計算:

      圖  3  碳納米線圈對骨肉瘤細胞施加力學刺激

      Figure 3.  Local mechanical stimulation on a single U?20S cell from a CNC

      ${F_{{\rm{CNC}}}} = k \times \Delta s,$

      其中,FCNC是碳納米線圈對細胞施加作用力的大小,Δs是碳納米線圈的彎曲形變量,k是碳納米線圈的橫向剛度,可通過振動激勵法測得[25-34]. 碳納米線圈能夠對骨肉瘤細胞施加102皮牛量級的力刺激. 圖3(c)展示了經Matlab軟件處理的骨肉瘤細胞受力前后的熒光比分布圖. 可以看到,當細胞受力后(t >5 min),其與碳納米線圈接觸點附近區域優先表現出熒光比升高. 隨著受力時間的延長,細胞其他區域的熒光比開始逐漸提高,表現出了極性分布和“擴散”行為,這表明碳納米線圈施加的局域力刺激大小不變,但隨著時間增長,仍將逐漸影響到細胞未受到直接作用的其它區域. 以上結果主要來自于細胞膜的流動性和細胞內部骨架的力傳導特性. 由于碳納米線圈與細胞之間可以視為點或線接觸,接觸部位的細胞膜優先發生形變,熒光比升高. 隨著作用時間的增長,細胞膜以及細胞內部的微管、纖維等細胞骨架將局域作用力傳遞到細胞的其它部分,導致細胞膜不斷發生變化,最終整體重新達到了一個相對均勻的新平衡狀態,逐漸熒光比. 圖3(b)展示了在碳納米線圈探針的局域作用下,骨肉瘤細胞熒光比隨時間的變化曲線. 可以看到,在碳納米線圈施加的恒定作用力下,細胞的熒光比不斷提高,可達40%. 這表明碳納米線圈的局域作用刺激效果具有累積效應,沒有破壞細胞的生理結構并能夠引起細胞的明顯響應.

      顯然,骨肉瘤細胞的熒光比變化程度與碳納米線圈探針對細胞的作用力大小有關,二者的關系如圖3(d)所示. 可以看到,當碳納米線圈的作用力小于500 pN時,細胞對外力大小并不敏感,同時實驗中觀察到的細胞熒光比極性分布現象也不明顯;而當作用力大于500 pN時,受激細胞的熒光比變化隨碳納米線圈柔性探針作用力的增大而提高,并表現出顯著的極性響應現象. 出現以上結果的原因可能與細胞本身的力學特性有關. 當外力較小時,細胞膜和細胞骨架未發生較大形變,呈整體響應外力的狀態;但當外力足夠大時,作用點附近的細胞膜和細胞骨架不能夠及時地將外力作用傳遞到細胞其它部分,整體性和穩定性受到破壞,導致細胞表現出明顯的極性響應行為和更大的細胞膜形變.

      圖4(a)所示,進一步利用碳納米線圈對細胞施加了具有一組梯度變化的作用力,每隔10 mim加大碳納米線圈的力刺激大小. 研究結果表明,骨肉瘤細胞的熒光比在一系列梯度力作用下并沒有表現出階梯狀的響應行為,其熒光比變化曲線如圖4(b)所示. 這可能是由于細胞對力學刺激的響應時間較長,不能在有限的時間內表現出較明顯的增長. 另外,由于更頻繁地改變碳納米線圈施力操作(加力1次→加力3次),實驗干擾增多,導致細胞熒光比變化曲線的噪聲變大. 實現骨肉瘤細胞受到變化外力的精確、實時受激響應檢測將是下一步的研究課題.

      圖  4  碳納米線圈對骨肉瘤細胞施加作用力時的熒光比變化曲線

      Figure 4.  The relationships between time and FRET ratio variation of a U?20S cell under mechanical stimulation from a CNC

    • 為了進一步研究骨肉瘤細胞的力應激特性,對骨肉瘤細胞施加了持續恒定的正壓力刺激. 如圖4(c)所示,將碳納米線圈探針正壓在骨肉瘤細胞的上表面,對細胞施加法向(垂直于細胞所在平面)正壓力. 圖4(d)展示了細胞熒光比隨時間變化曲線. 可以看到,細胞熒光比仍然隨時間逐漸增長,但變化量相對較?。ā?0%),且沒有觀察到細胞熒光比的極性分布現象. 這可能是由于骨肉瘤細胞處于貼壁狀態,其內部骨架構成的力傳導通道平行于培養基板排列,而碳納米線圈施加的作用力位于細胞中央區域,且沒有橫向分量,不能引起細胞膜的顯著橫向流動和力刺激向其它區域的傳導,因此不能觀察到細胞的極性響應. 這一結果側面驗證了前面橫向推力刺激實驗的結果和分析. 由以上研究結果可以看到,利用碳納米線圈柔性生物探針可以對單活體細胞施加不同形式和大小的作用力,有助于全面研究細胞力學應激特性.

    • 由于碳納米線圈具有優異的電學特性,可以將其作為柔性生物電極對細胞施加局域電刺激. 如圖5(a)所示,當碳納米線圈與細胞接觸時,其電位可以引起接觸點附近引起細胞膜電位發生反轉,從而對細胞產生局域電學刺激,在細胞中植入鈣離子熒光探針可以顯示細胞受到電刺激后的響應情況. 用信號發生器施加電刺激信號,碳納米線圈被固定在三維微操作儀上并引出電極接在信號發生器的負極. 由于細胞離子通道的激活時間一般在百毫秒量級,之后就會自動處于失活狀態,經過一段時間才會逐漸恢復到靜息狀態,因此施加持續穩定的電信號并不能使離子通道處于常開狀態. 基于以上認識,采用了周期性脈沖電刺激的方式,電學參數為周期7 s、脈沖寬度100 ms、幅度?100 mV,波形如圖5(b)所示. 鉑電極作為對電極置于細胞溶液中,將細胞溶液的電位鉗制為0 V.

      圖  5  碳納米線圈電極對骨肉瘤細胞施加電學刺激

      Figure 5.  Local electrical stimulation on a single cell from a CNC

      圖5(c)展示了經Matlab軟件處理的細胞受電刺激前后的熒光比分布圖. 當電刺激開始施加時(t=35 s),可以看到在碳納米線圈與細胞的接觸側優先表現出明顯的熒光比增強,即表現出極性響應行為;隨著刺激的持續施加,熒光比逐漸增高并向另一側擴散. 當電刺激消失時(t=77 s),細胞熒光比變為均勻分布并逐漸恢復. 圖5(d)展示了骨肉瘤細胞受激前后的熒光比變化曲線. 可以發現,當信號發生器開始產生電信號時(t=35 s),碳納米線圈可以使骨肉瘤細胞產生明顯的熒光變化,經過7個周期的電刺激后熒光比升高40%. 當刺激撤銷時(t=77 s),細胞熒光比幾乎恢復到初始水平. 這是由于撤銷電刺激后,細胞膜電位恢復,骨肉瘤細胞逐漸向胞外排出體內多余的鈣離子,鈣離子濃度的降低導致細胞熒光比的恢復. 鈣離子的動力學行為表明在局域電刺激的實驗過程中,骨肉瘤細胞的生理結構和生理功能沒有被碳納米線圈所破壞. 以上結果表明,碳納米線圈作為微納生物電極可以有效地實現細胞水平的局域電刺激,且具有安全性高和可控性好的優點,在細胞電學特性研究和動力學行為調控領域極具應用前景.

    • 本研究探索了碳納米線圈作為柔性生物探針在細胞力學、電學應激性研究方面的應用. 筆者首次利用碳納米線圈探針對骨肉瘤細胞施加定量局域作用力,發現細胞的受激響應與力刺激的形式和大小有關,在局域側推力的作用下顯示出極性響應. 另外,用碳納米線圈作為電極對細胞施加了局域電刺激,發現細胞表現出了明顯的極性響應以及響應傳導行為,細胞熒光比變化可達40%. 并且當電刺激撤銷后,受激細胞可恢復初始狀態,證明碳納米線圈具有安全可控性. 天然的生物兼容性、優異的力學性能和微小尺寸使得碳納米線圈可以作為非侵入柔性生物探針對細胞施加局域刺激,是活體細胞的力、電刺激響應和傳導機制研究、細胞動力學行為調控等領域的一種新型有效手段.

參考文獻 (34)

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