<acronym id="owqss"><center id="owqss"></center></acronym>
<acronym id="owqss"></acronym>
<acronym id="owqss"><center id="owqss"></center></acronym>

結核分枝桿菌新型亞單位疫苗的初步研究

時宇 陶玉芬 劉建生 劉紅旗

引用本文:
Citation:

結核分枝桿菌新型亞單位疫苗的初步研究

    作者簡介: 時 宇(1994?),女,吉林人,碩士生,主要從事結核新型疫苗方面的研究;
    通訊作者: 劉紅旗, lhq@Imbcams.com.cn
  • 中圖分類號: R378.911

Preliminary study on a novel subunit vaccine of Mycobacterium tuberculosis

    Corresponding author: LIU Hong-qi, lhq@Imbcams.com.cn
  • CLC number: R378.911

  • 摘要: 為了研發結核新型亞單位疫苗,以納米顆粒為載體展示結核分枝桿菌主要抗原ESAT6. 將ESAT6基因片段克隆到位于pGEX-4T-1載體上的諾如病毒P結構域的Loop2中,轉入大腸桿菌BL21(DE3)進行表達,用GST親和柱純化,并通過FPLC分析嵌合納米顆粒的形成效率,最后免疫BALB/c小鼠進行免疫原性的評價. 結果表明:研究成功地將ESAT6基因克隆至諾如病毒P結構域的Loop2中,且空間結構模擬提示ESAT6能展示在P納米顆粒的表面. FPLC分析表明,表達的嵌合蛋白可以高效地自我組裝成納米顆粒. 用該嵌合顆粒免疫小鼠后,能誘導產生針對ESAT6重組嵌合顆粒的特異性抗體. 進一步分析發現,誘導的抗體主要針對ESAT6的51~70肽段,而不是1~20肽段. 綜上,研究通過諾如病毒P顆粒成功地展示了結核分枝桿菌主要抗原ESAT6,為進一步研發結核新型亞單位疫苗奠定了基礎.
  • 圖 1  pGEX4T1-VA387-P和pWSV- H37RvESAT6HL質粒圖譜

    Figure 1.  Plasmid maps of pGEX4T1-VA387-P and pWSV- H37RvESAT6HL

    圖 2  重組質粒的構建和鑒定

    Figure 2.  Construction and identification of recombinant plasmid

    圖 3  P結構域-ESAT6嵌合蛋白空間結構

    Figure 3.  Structure of P domain-ESAT6 chimeric protein

    圖 4  表達和純化后的嵌合蛋白分析

    Figure 4.  Analysis of expressed and purified chimeric protein

    圖 5  酶切后嵌合蛋白的FPLC純化和分析

    Figure 5.  Analysis of purified chimeric protein by FPLC after enzyme digestion

    圖 6  免疫小鼠特異性抗體檢測

    Figure 6.  Detection of specific antibody in immunized mice

    表 1  ESAT6中和表位氨基酸序列

    Table 1.  Amino acid sequences of ESAT6 neutralizing epitopes

    表位名稱長度/aa氨基酸序列
    ESAT-61~2020MTEQQWNFAGIEAAASAIQG
    ESAT-651~7020YQGVQQKWDATATELNNALQ
    下載: 導出CSV

    表 2  PCR合成ESAT6的引物序列

    Table 2.  The primer nucleotide sequences of ESAT6 synthesized by PCR

    引物名稱引物序列
    F-PrimerCTGTTCAGTACACCACTAGTACTAGTACAG
    R-PrimerCGGTCTGCAGGATATGGCCGCTGCGAACAT
    下載: 導出CSV
    鸿禾娱乐
  • [1] Word Health Organization, Global tuberculosis report 2019[R]. Geneva: Word Health Organization, 2019.
    [2] Matteelli A, Sulis G, Capone S, et al. Tuberculosis elimination and the challenge of latent tuberculosis[J]. Presse Medicale, 2017, 46(2): e13-e21. DOI:  10.1016/j.lpm.2017.01.015.
    [3] 袁方, 陳元曉, Dawes S, 等. 結核分枝桿菌H37Ra FadD3基因克隆與表達研究[J]. 云南大學學報: 自然科學版, 2014, 36(4): 600-605. DOI:  10.7540/j.ynu.20140040. Yuan F, Chen Y X, Dawes S, et al. Cloning and expression of (fatty Acyl-CoA synthetase) gene FadD3 in Mycobacterium tuberculosis H37Ra[J]. Journal of Yunnan University: Natural Sciences Edition, 2014, 36(4): 600-605.
    [4] You X, Li R, Wan K, et al. Evaluation of Rv0220, Rv2958c, Rv2994 and Rv3347c of Mycobacterium tuberculosis for serodiagnosis of tuberculosis[J]. Microbial Biotechnology, 2017, 10(3): 604-611. DOI:  10.1111/1751-7915.12697.
    [5] Ren N, JinLi J, Chen Y, et al. Identification of new diagnostic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis and the potential application in the serodiagnosis of human tuberculosis[J]. Microbial Biotechnology, 2018, 11(5): 893-904. DOI:  10.1111/1751-7915.13291.
    [6] Malik A, Gupta M, Mani R, et al. Single-dose Ag85B-ESAT6-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles confer protective immunity against tuberculosis[J]. International Journal of Nanomedicine, 2019, 14: 3 129-3 143. DOI:  10.2147/ijn.s172391.
    [7] Orme I M. Tuberculosis vaccine types and timings[J]. Clinical and Vaccine Immunology: CVI, 2015, 22(3): 249-257. DOI:  10.1128/cvi.00718-14.
    [8] Wang C, Lu J, Du W, et al. Ag85b/ESAT6-CFP10 adjuvanted with aluminum/poly-IC effectively protects guinea pigs from latent mycobacterium tuberculosis infection[J]. Vaccine, 2019, 37(32): 4 477-4 484. DOI:  10.1016/j.vaccine.2019.06.078.
    [9] Mahase E. Millions of people are still missing out on TB treatment, says WHO[J]. British Medical Journal, 2019, 367: l6 097. DOI:  10.1136/bmj.l6097.
    [10] Daley C L. The global fight against tuberculosis[J]. Thoracic Surgery Clinics, 2019, 29(1): 19-25. DOI:  10.1016/j.thorsurg.2018.09.010.
    [11] Gupta N, Garg S, Vedi S, et al. Future path toward TB vaccine development: Boosting BCG or re-educating by a new subunit vaccine[J]. Frontiers in Immunology, 2018, 9: 2 371. DOI:  10.3389/fimmu.2018.02371.
    [12] Turbawaty D K, Sugianli A K, Soeroto A Y, et al. Comparison of the performance of urinary mycobacterium tuberculosis antigens cocktail (ESAT6, CFP10, and MPT64) with culture and microscopy in pulmonary tuberculosis patients[J]. International Journal of Microbiology, 2017, 2017: 3259329. DOI:  10.1155/2017/3259329.
    [13] Gonzalo-Asensio J, Marinova D, Martin C, et al. MTBVAC: Attenuating the human pathogen of tuberculosis (TB) toward a promising vaccine against the TB epidemic[J]. Frontiers in Immunology, 2017, 8: 1803. DOI:  10.3389/fimmu.2017.01803.
    [14] Jang A R, Kim G, Hong J J, et al. Mycobacterium tuberculosis ESAT6 drives the activation and maturation of bone marrow-derived dendritic cells via TLR4-Mediated signaling[J]. Immune Network, 2019, 19(2): e13. DOI:  10.4110/in.2019.19.e13.
    [15] Jang A R, Choi J H, Shin S J, et al. Mycobacterium tuberculosis ESAT6 induces IFN-beta gene expression in Macrophages via TLRs-mediated signaling[J]. Cytokine, 2018, 104: 104-109. DOI:  10.1016/j.cyto.2017.10.006.
    [16] Tan M, Jiang X. Recent advancements in combination subunit vaccine development[J]. Human Vaccines & Immunotherapeutics, 2017, 13(1): 180-185. DOI:  10.1080/21645515.2016.1229719.
    [17] Fang H, Tan M, Xia M, et al. Norovirus P particle efficiently elicits innate, humoral and cellular immunity[J]. PloS One, 2013, 8(4): e63269. DOI:  10.1371/journal.pone.0063269.
    [18] Fu L, Jin H, Yu Y, et al. Characterization of NoV P particle-based chimeric protein vaccines developed from two different expression systems[J]. Protein Expression and Purification, 2017, 130: 28-34. DOI:  10.1016/j.pep.2016.09.015.
    [19] Tan M, Jiang X. Norovirus capsid protein-derived nanoparticles and polymers as versatile platforms for antigen presentation and vaccine development[J]. Pharmaceutics, 2019, 11(9): 472. DOI:  10.3390/pharmaceutics11090472.
    [20] Olsen A W, Hansen P R, Holm A, et al. Efficient protection against Mycobacterium tuberculosis by vaccination with a single subdominant epitope from the ESAT-6 antigen[J]. European Journal of Immunology, 2000, 30(6): 1 724-1 732. DOI: 10.1002/1521-4141(200006)30:6<1724::aid-immu1724>3.0.co;2-a.
    [21] van Aalst S, Ludwig I S, van Kooten P J S, et al. Dynamics of APC recruitment at the site of injection following injection of vaccine adjuvants[J]. Vaccine, 2017, 35(12): 1 622-1 629. DOI:  10.1016/j.vaccine.2017.02.005.
    [22] Hafner A M, Corthesy B, Textor M, et al. Surface-assembled poly(I: C) on PEGylated PLGA microspheres as vaccine adjuvant: APC activation and bystander cell stimulation[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2016, 514(1): 176-188. DOI:  10.1016/j.ijpharm.2016.07.042.
    [23] Soleimanpour S, Farsiani H, Mosavat A, et al. APC targeting enhances immunogenicity of a novel multistage Fc-fusion tuberculosis vaccine in mice[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(24): 10 467-10 480. DOI:  10.1007/s00253-015-6952-z.
  • [1] 王國偉施樹春 . 銅納米顆粒的制備與表征. 云南大學學報(自然科學版), 2008, 30(4): 388-391.
    [2] 李燕博楊自騰馬嵐 . HPV-58型E7蛋白抗原模擬表位的篩選及分析. 云南大學學報(自然科學版), 2014, 36(6): 920-927. doi: 10.7540/j.ynu.20140142
    [3] 鄭勇林楊敏 . 磁性納米顆粒系統的鐵磁共振和共振線寬分析. 云南大學學報(自然科學版), 2007, 29(4): 386-392.
    [4] 鄭勇林 . 鐵磁納米顆粒系統磁性質對尺寸和各向異性效應的依賴. 云南大學學報(自然科學版), 2008, 30(3): 276-280.
    [5] . 肽-DNA納米顆粒用于HIF-1ODD轉染脊髓損傷動物模型的研究. 云南大學學報(自然科學版), 2013, 35(1): 108-113. doi: 10.7540/j.ynu.2012.12343
    [6] 劉儀劉婷知胡蓉白茹燕張坤蕾鄭麗楊云慧 . 基于Ag-Pt納米顆粒標記型C-反應蛋白免疫傳感器的研制. 云南大學學報(自然科學版), 2015, 37(6): 888-895. doi: 10.7540/j.ynu.20150415
    [7] 鄭慶瑤熊晶晶程園園Staphylococcus saprophyticus JJ-1協同所合成的鈀納米顆粒還原鄰氯硝基苯. 云南大學學報(自然科學版), 2020, 42(1): 149-155. doi: 10.7540/j.ynu.20190389
    [8] 王昆州范江俠晏敏皓 . 高穩定性水基γ-Fe2O3超順磁納米顆粒制備及其表面改性研究. 云南大學學報(自然科學版), 2017, 39(5): 829-836. doi: 10.7540/j.ynu.20160327
    [9] 袁方陳元曉StephanieDawesEdwardN.Baker . 結核分枝桿菌H37Ra FadD3基因克隆與表達研究. 云南大學學報(自然科學版), 2014, 36(4): 600-605. doi: 10.7540/j.ynu.20140040
    [10] 易平閔勇古昆邱明華 . 硝基呋喃銨類化合物抗肺結核活性的CoMFA研究. 云南大學學報(自然科學版), 2006, 28(1): 54-59.
    [11] 向文彬楊志雷柳桐柴俊王生奎張以芳 . 兩株偽結核棒狀桿菌的分離、16S-rRNA鑒定及藥敏試驗分析. 云南大學學報(自然科學版), 2013, 35(S1): 65-70. doi: 10.7540/j.ynu.2013a16
    [12] 鄭麗趙錦航牛小方李能麗楊云慧 . 基于銀鈀鉑復合納米材料標記的癌胚抗原免疫傳感器的研制. 云南大學學報(自然科學版), 2014, 36(4): 557-563. doi: 10.7540/j.ynu.20130771
    [13] 耿森林李芳菊 . 大顆粒糧食中聲傳播性質研究. 云南大學學報(自然科學版), 2008, 30(6): 583-586.
    [14] 高玨翟應田 . 幾類常用儀器分析譜圖的量與單位. 云南大學學報(自然科學版), 2011, 33(S2): 59-62.
    [15] 黃光球雷哲 . 西安市大氣顆粒物PM2.5的輸送路徑和潛在源分析. 云南大學學報(自然科學版), 2019, 41(6): 1191-1200. doi: 10.7540/j.ynu.20190157
    [16] 宋霞段維國全文琦黃鎧張曉麗張云昆謝明學謝忠平 . OPV疫苗液體劑型穩定性影響因素分析. 云南大學學報(自然科學版), 2008, 30(1): 98-100,108.
    [17] 李國棟李本林陳曉熠張勇 . 低成本無團聚納米氧化鋅的制造. 云南大學學報(自然科學版), 2003, 25(5): 423-427.
    [18] 李茂瓊項金鐘胡永茂方靜華陳光學張桂琴吳興惠 . 納米SiO2的制備及性能研究. 云南大學學報(自然科學版), 2002, 24(6): 445-448.
    [19] 虞瀾史聰花彭巨擘張捷 . 氧化鋁納米陣列模板的制備和研究. 云南大學學報(自然科學版), 2002, 24(3): 211-214.
    [20] 李德蕾戴坤張茜張坤蕾白茹燕胡蓉楊云慧 . 基于納米多孔鉑檢測細胞中多巴胺. 云南大學學報(自然科學版), 2017, 39(3): 447-453. doi: 10.7540/j.ynu.20160455
  • 加載中
圖(6)表(2)
計量
  • 文章訪問數:  374
  • HTML全文瀏覽量:  356
  • PDF下載量:  14
  • 被引次數: 0
出版歷程
  • 收稿日期:  2020-03-15
  • 錄用日期:  2020-05-11
  • 網絡出版日期:  2020-06-23
  • 刊出日期:  2020-07-01

結核分枝桿菌新型亞單位疫苗的初步研究

    作者簡介:時 宇(1994?),女,吉林人,碩士生,主要從事結核新型疫苗方面的研究
    通訊作者: 劉紅旗, lhq@Imbcams.com.cn
  • 中國醫學科學院/北京協和醫學院 醫學生物學研究所 感染和免疫實驗室,云南 昆明 650118

摘要: 為了研發結核新型亞單位疫苗,以納米顆粒為載體展示結核分枝桿菌主要抗原ESAT6. 將ESAT6基因片段克隆到位于pGEX-4T-1載體上的諾如病毒P結構域的Loop2中,轉入大腸桿菌BL21(DE3)進行表達,用GST親和柱純化,并通過FPLC分析嵌合納米顆粒的形成效率,最后免疫BALB/c小鼠進行免疫原性的評價. 結果表明:研究成功地將ESAT6基因克隆至諾如病毒P結構域的Loop2中,且空間結構模擬提示ESAT6能展示在P納米顆粒的表面. FPLC分析表明,表達的嵌合蛋白可以高效地自我組裝成納米顆粒. 用該嵌合顆粒免疫小鼠后,能誘導產生針對ESAT6重組嵌合顆粒的特異性抗體. 進一步分析發現,誘導的抗體主要針對ESAT6的51~70肽段,而不是1~20肽段. 綜上,研究通過諾如病毒P顆粒成功地展示了結核分枝桿菌主要抗原ESAT6,為進一步研發結核新型亞單位疫苗奠定了基礎.

English Abstract

  • 結核病(Tuberculosis, TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)引起的全球感染率和死亡率最高的疾病[1-3]. 據估計,全球三分之一的人口在感染結核分枝桿菌的潛伏期,這一潛伏期隨時可能轉變為活動性結核[4-5],對于工業化國家和發展中國家,接種結核疫苗依舊是預防結核病成本最低且有效的方法. 迄今為止,卡介苗仍是唯一可用的結核疫苗[6],可是它在預防成人肺結核方面基本無效[7],而且不能預防結核病的潛伏感染[8-10]. 因此,迫切需要一種有效的結核疫苗來預防結核病. 結核分枝桿菌早期抗原分泌靶6(the 6 kDa early secreted antigenic target produced by Mycobacterium tuberculosis, ESAT6)是活動性結核感染相關的主要抗原. ESAT6是由95個氨基酸構成的低分子量分泌蛋白,它是由大小為288 bp的Rv3875基因編碼(Genbank:886209),這些基因位于結核桿菌基因組的RD1中,但是所有卡介苗均缺失了RD1區域[11-12]. ESAT6在毒力中的作用已被實驗證實,缺乏ESAT6的卡介苗與RD1互補后,其在不同動物模型中的保護效果顯著增強,提示卡介苗的保護不足可能是由于這些主要抗原的缺失所致. 因為ESAT6在結核分枝桿菌毒力和發病機制中發揮重要作用[12-13],所以許多試驗旨在開發針對ESAT6的高效結核疫苗[14-15]. 基于ESAT6的亞單位疫苗在動物模型中已顯示了巨大的潛力,我們選擇ESAT6作為新型結核疫苗的主要抗原. 雖然以ESAT6作為抗原免疫動物能產生有效的中和抗體,但它的分子量相對較小,作為亞單位疫苗的抗原仍面臨低免疫原性的問題. 這個問題可以通過將抗原嵌合到一個相對較大、多價的、高免疫原性的亞病毒顆粒上來解決[16].

    研究表明,諾如病毒P結構域(VA387,GI:146387016)由327個氨基酸構成,它單獨表達能自發組裝成納米顆粒,且能作為載體呈遞外源抗原,是新型疫苗開發的良好平臺[16-19]. 因此,本研究嘗試通過諾如病毒P顆粒來展示結核分枝桿菌的主要抗原ESAT6,為制備結核新型亞單位疫苗奠定基礎.

    • 6周齡雌性BALB/c鼠,由中國醫學科學院醫學生物學研究所動物中心提供,實驗動物生產許可證(SCXK(滇)K2014-002),使用許可證(SYXK(滇)K2014-007),所有動物使用程序都由中國醫學科學院醫學生物學研究所實驗動物倫理委員會審查和批準.

    • 大腸桿菌原核表達質粒pGEX4T1-VA387-P(圖1)來自美國辛辛那提兒童醫學研究中心譚明博士實驗室,質粒骨架為pGEX-4-T-1,包含了GII.4型諾如病毒VA387株的P結構域和GST標簽. ESAT6基因根據結核分枝桿菌H37Rv株的ESAT6蛋白的氨基酸序列(Genbank:886209),經密碼子優化后通過人工方法合成,委托北京唯尚立德生物科技有限公司完成,保存于質粒pWSV-H37Rv ESAT6HL中. E. coli DH5a和E. coli BL21(DE3)感受態細胞購自昆明碩擎生物科技有限公司.

      圖  1  pGEX4T1-VA387-P和pWSV- H37RvESAT6HL質粒圖譜

      Figure 1.  Plasmid maps of pGEX4T1-VA387-P and pWSV- H37RvESAT6HL

    • 限制性內切酶SpeⅠ、ClaⅠ購自New England Biolabs;無縫克隆試劑盒購自TAKARA公司;質粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;IPTG購自天根生物技術有限公司;蛋白酶Thrombin,GST融合蛋白預裝柱及FPLC純化柱Hiload 16/600 superdex 200pg購自GE healthcare公司;還原型L-Glutathione及弗氏佐劑購自Sigma-Aldrich公司,GST Rabbit mAb, Anti-mouse IgG及Anti-rabbit IgG購自Cell Signaling Technology公司;Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate購自Thermo公司;TMB LIQUID-1 COMPONENT購自Amresco公司.

    • 根據文獻報道,獲取ESAT6兩個中和表位的氨基酸序列[20],如表1所示,由上海昕浩生物技術有限公司合成.

      表位名稱長度/aa氨基酸序列
      ESAT-61~2020MTEQQWNFAGIEAAASAIQG
      ESAT-651~7020YQGVQQKWDATATELNNALQ

      表 1  ESAT6中和表位氨基酸序列

      Table 1.  Amino acid sequences of ESAT6 neutralizing epitopes

    • 根據無縫克隆試劑盒連接指南設計引物,如表2所示,由昆明碩擎生物科技有限公司合成.

      引物名稱引物序列
      F-PrimerCTGTTCAGTACACCACTAGTACTAGTACAG
      R-PrimerCGGTCTGCAGGATATGGCCGCTGCGAACAT

      表 2  PCR合成ESAT6的引物序列

      Table 2.  The primer nucleotide sequences of ESAT6 synthesized by PCR

      通過PCR將ESAT6基因從合成的質粒中擴增出來,通過無縫克隆連接到經SpeⅠ和ClaⅠ兩個內切酶酶切后的pGEX4T1-VA387-P質粒中,電泳檢測后,送昆明碩擎生物科技有限公司測序驗證.

    • 基于蛋白質的氨基酸序列,通過在線蛋白質結構預測工具SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/interactive)預測被展示的ESAT6抗原在嵌合納米顆粒中的位置.

    • 將驗證正確的重組質粒轉化到E.coli BL21(DE3)感受態細胞中,涂布到含氨芐青霉素(50 ng/mL)的LB培養基上,挑取陽性克隆,接種到含氨芐青霉素(50 ng/mL)的LB培養液中,于37 ℃、220 r/min的搖床過夜培養. 次日按1∶50轉接,再于37 ℃、220 r/min條件下繼續培養至菌液OD600在0.4~0.6之間,加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,而后12 ℃過夜誘導表達. 收集菌液(12000×g、4 ℃離心10 min),用PBS(pH=7.4)重懸后,冰浴超聲破碎,收集上清和沉淀,通過10% SDS-PAGE進行分析.

    • 誘導表達的蛋白以部分可溶性的形式存在,使用GST預裝柱(GE)親和純化超聲上清液,用20 mmol/L還原型谷胱甘肽作為洗脫液,洗脫蛋白,通過10% SDS-PAGE進行分析.

    • 含GST標簽的嵌合蛋白經酶切后,通過Hiload 16/600 superdex 200 pg柱(GE)在AKTA純化系統中,進行FPLC檢測,并收集蛋白樣品,進行SDS-PAGE和免疫印跡分析.

    • 實驗動物雌性BALB/c小鼠共12只,完全隨機分組. 免疫抗原(P顆粒、ESAT6與P結構域嵌合顆粒)分別與弗氏佐劑等體積混合乳化后,通過肌肉注射免疫動物(0.3 mg/mL,每只取100 μL蛋白液與等量佐劑乳化,小鼠左右大腿肌肉各注射1針次(共200 μL/只)),免疫4次,每次間隔2周. 第1次免疫使用弗氏完全佐劑乳化蛋白液,第2次免疫用弗氏不完全佐劑乳化蛋白液. 最后2次免疫都只注射蛋白液不加任何佐劑.

    • 用稀釋至5μg/mL的ESAT6中和表位肽段、諾如病毒P結構域蛋白、諾如病毒P結構域和ESAT6嵌合蛋白包被96孔板,每孔加100 μL蛋白液,4 ℃過夜進行包被. 次日取出,洗滌后每孔加入200 μL的5%脫脂牛奶,37 ℃封閉1 min;洗滌后,每孔加入100 μL的稀釋的血清樣品,37 ℃孵育1 h;洗滌后,每孔加入100 μL 1∶5000抗鼠IgG,37 ℃孵育1 h;洗滌后,每孔加入100 μL TMB顯色液,37 ℃顯色30 min后加終止液(2 mol/L H2SO4)100 μL/孔,檢測OD450.

    • 重組質粒通過無縫克隆的方法構建. 將ESAT6基因片段克隆至SpeⅠ和ClaⅠ雙酶切后的P結構域載體,經DNA電泳進行鑒定. 結果顯示,預期大小的DNA片段成功克隆到P結構域中(圖2). 進一步的測序驗證了重組質粒的基因序列正確,且融合基因的閱讀框完整.

      圖  2  重組質粒的構建和鑒定

      Figure 2.  Construction and identification of recombinant plasmid

    • 通過在線蛋白質結構預測工具SWISS-MODEL對諾如病毒P結構域蛋白及其與ESAT6的嵌合蛋白的空間結構進行預測. 結果表明,ESAT6能很好地展現在諾如病毒P結構域二聚體的表面,尤其是ESAT6的51~70氨基酸肽段(圖3).

      圖  3  P結構域-ESAT6嵌合蛋白空間結構

      Figure 3.  Structure of P domain-ESAT6 chimeric protein

    • SDS-PAGE分析結果(圖4)表明,ESAT6與諾如病毒P結構域嵌合蛋白能在大腸桿菌中穩定高效表達,部分以可溶性蛋白的形式存在. 通過GST親和純化,能從每升培養物的超聲上清中得到1 mg的GST融合蛋白.

      圖  4  表達和純化后的嵌合蛋白分析

      Figure 4.  Analysis of expressed and purified chimeric protein

    • 使用Hiload 16/600 superdex 200pg柱(GE)和FPLC純化和分析酶切后的嵌合蛋白,評價顆粒的形成效率. FPLC結果表明,P結構域蛋白和其與ESAT6嵌合蛋白的顆粒自組效率都大于95%,SDS-PAGE和Western blot結果進一步驗證了FPLC分析圖中2個主峰的蛋白質為預期大小的相對分子質量(圖5A5B).

      圖  5  酶切后嵌合蛋白的FPLC純化和分析

      Figure 5.  Analysis of purified chimeric protein by FPLC after enzyme digestion

    • 于免疫后不同的時間點,收集小鼠血清,通過ELISA方法檢測針對免疫原的特異性抗體. 結果表明,P結構域蛋白和P結構域-ESAT6嵌合蛋白都能誘導產生針對P結構域蛋白的特異性抗體,免疫后第8周的抗體效價均為1∶1 280k(圖6A圖6B). 然而,用嵌合蛋白包被ELISA板檢測發現,P結構域蛋白免疫血清和其與ESAT6嵌合蛋白免疫血清的第8周抗體效價分別為1∶1 280k和1∶2 560k(圖6C圖6D),說明嵌合蛋白誘導產生了針對2種蛋白的抗體. 進一步用ESAT61-20和ESAT651-70中和表位肽段包被進行ELISA分析,結果表明嵌合蛋白中ESAT6誘導產生的抗體主要是針對ESAT651-70肽段,免疫后第八周抗體效價為1∶400(圖6F),幾乎不產生針對ESAT61-20肽段的抗體(圖6E).

      圖  6  免疫小鼠特異性抗體檢測

      Figure 6.  Detection of specific antibody in immunized mice

    • 結核病是由單一傳染病病原體感染引起死亡率最高的疾病[10],目前的主要預防手段仍是接種保護力有限的卡介苗[6]. 因此,研發高效、安全的新型結核疫苗的工作刻不容緩. 抗原提呈細胞的激活在疫苗誘導的免疫反應中起重要作用[21-23]. 重組表達的諾如病毒P結構域能自發地形成穩定的納米顆粒,具有很好的免疫原性[17-19]. 因此,本研究試圖探索諾如病毒P顆粒能否展示結核早期抗原ESAT6. 結果表明,ESAT6和諾如病毒P結構域形成的嵌合蛋白能高效地自組成顆粒,且具有較好的免疫原性,能誘導產生針對這兩種抗原的特異性抗體.

      進一步分析發現,嵌合ESAT6片段沒有降低其對諾如病毒P結構域應有的免疫原性,保持了兩種抗原的相對獨立性,提示利用諾如病毒P結構域呈遞結核抗原ESAT6制備二價疫苗的可行性. 然而,諾如病毒P結構域形成的納米顆粒在此是否能發揮其佐劑的效應,還有待進一步的研究.

      結核早期抗原ESAT6中有2個重要的中和抗原表位ESAT61-20和ESAT651-70[20]. 本研究將ESAT6基因克隆到諾如病毒P結構域后,蛋白質結構預測結果表明,形成的嵌合P結構域納米顆粒中ESAT651~70肽段可能被展示在顆粒表面,而ESAT61~20肽段則可能被包埋在顆粒里面(圖6E). 實驗結果證實了這一預測,嵌合納米顆粒誘導的抗體主要是針對ESAT651~70中和表位(圖6F).

      本研究驗證了諾如病毒P結構域能與結核早期抗原ESAT6形成嵌合納米顆粒,且能誘導中和抗體的產生,這些研究成果為后期進一步研發結核安全、高效的新型納米顆粒疫苗奠定了基礎.

參考文獻 (23)

目錄

    /

    返回文章
    返回